Zunächst hinterlassen sowohl EcoR1 als auch Xba1 5'-Überhänge, wenn sie DNA verdauen (ebenso wie Nde1). In beiden Fällen ist das 3'-Ende zurückgesetzt, weshalb Polymerase Basen hinzufügen kann. Zweitens können alle Polymerasen nur Basen an ein 3'-Ende anfügen, also fügt Klenow 4 Basen an das zurückweichende 3'-Ende beider Seiten an, um stumpfe Enden zu erzeugen.
Lassen Restriktionsenzyme ein 5-Phosphat zurück?
Vektoren und Inserts, die durch Restriktionsenzyme verdaut wurden, enth alten die notwendigen terminalen Modifikationen (5'-Phosphat und 3'-Hydroxyl), während Fragmente, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt wurden, dies möglicherweise nicht tun.
Können stumpfe Enden ligiert werden?
Blunt-End-Ligation
Blunt-End-Ligation beinh altet keine Basenpaarung der hervorstehenden Enden, daher kann jedes stumpfe Ende mit einem anderen stumpfen Ende ligiert werden. Stumpfe Enden können durch Restriktionsenzyme wie SmaI und EcoRV erzeugt werden.
Erzeugt die Taq-Polymerase stumpfe Enden?
Ja… Taq-Polymerase fügt A-Überhänge hinzu, wenn Sie den letzten Verlängerungsschritt auf PCR bei 72 dC h alten. Wird hauptsächlich für TA-Klonen verwendet.
Warum Klenow-Fragment bei der DNA-Sequenzierung verwenden?
Das Klenow-Fragment ist äußerst nützlich für forschungsbasierte Aufgaben wie: Synthese von doppelsträngiger DNA aus einzelsträngigen Templates . Auffüllen zurückweichender 3'-Enden von DNA-Fragmenten, um den 5'-Überhang stumpf zu machen . Überstehende 3'-Überhänge verdauen.
